類器官是在體外培養(yǎng)的來源于干細(xì)胞的具有自組織特性的一種三維細(xì)胞結(jié)構(gòu),是一種簡(jiǎn)單的、微觀的器官模型。
一、類器官的分類
表1 類器官根據(jù)其來源的分類
來源 | 多能干細(xì)胞 (Pluripotent stem cells,PSCs) | 成體干細(xì)胞 (Adult stem cells,ASCs) | 腫瘤類器官 (Patient-derived organoids,PODs) | |
胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells,ESCs) | 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (Induced pluripotent stem cells,iPSCs) | |||
種類 | 如胃、肺、肝和腎等 | 包括幾乎所有消化系統(tǒng)的類器官 (肝臟、胰腺、結(jié)直腸、胃、膽 囊等),以及部分非消化系統(tǒng)的類器官 (前列腺、乳腺、肺等) | 乳腺癌、肺癌、前列腺癌、食管癌、胰腺癌、膀胱癌、肝癌、肺癌、宮頸癌、卵巢癌、腸癌、胃癌 |
1.多能干細(xì)胞來源的類器官
多能干細(xì)胞具有無限自我更新并分化為幾乎所有器官特異性的細(xì)胞類型。ESCs來源于囊胚期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的全能干細(xì)胞,但因其應(yīng)用涉及到倫理問題導(dǎo)致其使用受限。iPSCs類器官的形成過程:
這些類器官培養(yǎng)基北京百奧創(chuàng)新科技有限公司可以提供,產(chǎn)品如下:
2.成體干細(xì)胞來源的類器官
成體組織干細(xì)胞ASCs通常來源于患者的活檢組織,但其分化能力有限,而且ASCs類器官一般僅含有器官的上皮部分,缺乏基質(zhì)、神經(jīng)和血管系統(tǒng),培養(yǎng)體系相對(duì)比較簡(jiǎn)單,比如小腸類器官的培養(yǎng):
3.腫瘤類器官
腫瘤類器官可保留腫瘤組織的生物學(xué)特征和異質(zhì)性,具有多次傳代后基因組保持穩(wěn)定、培養(yǎng)周期短等優(yōu)勢(shì),可作為腫瘤研究的理想模型。
二、類器官的構(gòu)建與培養(yǎng)
1.不同來源類器官的構(gòu)建
2.以腸癌類器官為例的類器官培養(yǎng)步驟:
實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
(1)15 mL無菌離心管、1.5 mL離心管、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、移液器、移液管、無菌槍頭等表面消毒后放入超凈工作臺(tái)中紫外照射30 min。
(2)提前30 min從4℃冰箱取出腸癌類器官培養(yǎng)基(北京百奧創(chuàng)新科技有限公司提供)平衡至室溫,提前1 h從-20℃冰箱取出所需體積的基質(zhì)膠冰上融化。
腸癌類器官培養(yǎng)
(1)將獲取的腸癌原代細(xì)胞懸液計(jì)數(shù),根據(jù)計(jì)算好的體積吸取細(xì)胞懸液加入預(yù)冷的1.5 mL離心管中,補(bǔ)齊預(yù)冷的腸癌類器官培養(yǎng)基至所需體積。
(2)將預(yù)冷后的細(xì)胞懸液加入等體積的基質(zhì)膠中輕輕混勻(全程冰上操作),避免氣泡,使腸癌原代細(xì)胞終濃度為5×105個(gè)細(xì)胞/毫升。然后將細(xì)胞與基質(zhì)膠的混合液按照50 μL/孔呈半球形點(diǎn)膠于24孔板。
(3)將培養(yǎng)板放入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱終至少30 min,待基質(zhì)膠*凝固。沿孔壁每孔緩慢加入500 μL預(yù)先恢復(fù)至室溫的類器官培養(yǎng)基,放置5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
(4)3天后鏡下觀察類器官形成情況,粒徑大于30~50 μm即認(rèn)為類器官已經(jīng)形成。
(2)將預(yù)冷后的細(xì)胞懸液加入等體積的基質(zhì)膠中輕輕混勻(全程冰上操作),避免氣泡,使腸癌原代細(xì)胞終濃度為5×105個(gè)細(xì)胞/毫升。然后將細(xì)胞與基質(zhì)膠的混合液按照50 μL/孔呈半球形點(diǎn)膠于24孔板。
(3)將培養(yǎng)板放入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱終至少30 min,待基質(zhì)膠*凝固。沿孔壁每孔緩慢加入500 μL預(yù)先恢復(fù)至室溫的類器官培養(yǎng)基,放置5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
(4)3天后鏡下觀察類器官形成情況,粒徑大于30~50 μm即認(rèn)為類器官已經(jīng)形成。
(5)每5天更換一次培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),持續(xù)觀察類器官大小,鏡下觀察大部分類器官大小均大于30~50 μm且大小不再增大即可收集類器官進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
腸癌類器官收集
(1)棄培養(yǎng)基,每孔加入200 μL基質(zhì)膠解離試劑,室溫放置1 min,輕輕吹打混勻,收集至15 mL離心管中。
(2)50 rpm恒溫震蕩解離10-20 min,解離之后1500 rpm離心3 min,輕吸去上清,待用。
腸癌類器官傳代
(1)收集的類器官,加入適量的消化酶,37℃,200 rpm消化(具體時(shí)間根據(jù)類器官大小和數(shù)量決定,以肉眼可見顆粒明顯減小一半為準(zhǔn),可中間取消化的類器官顯微鏡觀察,類器官消化至3~10個(gè)細(xì)胞集合體理想)。
(2)消化*后1500 rpm離心3 min,棄上清,使用清洗液重懸后1500 rpm離心3 min;加入預(yù)冷的腸癌類器官培養(yǎng)基進(jìn)行重懸,計(jì)數(shù),按照培養(yǎng)步驟操作繼續(xù)培養(yǎng)。
三、不同種類類器官形貌圖
(a)小腸類器官.(b)結(jié)腸類器官.(c)食管類器官.(d)胃類器官.(e)肝臟類器官.
(f)胰腺類器官.(g)肺類器官.(h)乳腺類器官.(i)腎類器官.(j)腦類器官.